一,基本原理
二,應(yīng)用范圍
三,儀器結(jié)構(gòu)
一,基本原理
利用紫外－可見(jiàn)吸收光譜來(lái)進(jìn)行定量分析由來(lái)已久，可追溯到古代，公元60年古希臘已經(jīng)知道利用五味子浸液來(lái)估計(jì)醋中鐵的含量，這一古老的方法由于zui初是運(yùn)用人眼來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，所以又稱比色法。到了16、17世紀(jì)，相關(guān)分析理論開(kāi)始蓬勃發(fā)展，1852年，比爾（Beer）參考了布給爾（Bouguer）1729年和朗伯（Lambert）在1760年所發(fā)表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液層厚度相等時(shí)，顏色的強(qiáng)度與呈色溶液的濃度成比例，從而奠定了分光光度法的理論基礎(chǔ)，這就是的朗伯－比爾定律。
1．紫外－可見(jiàn)吸收光譜的形成
吸光光度法也稱做分光光度法，但是分光光度法的概念有些含糊，分光光度是指儀器的功能，即儀器進(jìn)行分光并用光度法測(cè)定，這類儀器包括了分光光度計(jì)與原子吸收光譜儀（AAS）。吸光光度法的本質(zhì)是光的吸收，因此稱吸光光度法比較合理，當(dāng)然，稱分子吸光光度法是zui確切的。
紫外－可見(jiàn)吸收光譜是物質(zhì)中分子吸收200-800nm光譜區(qū)內(nèi)的光而產(chǎn)生的。這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價(jià)電子和分子軌道上的電子在電子能級(jí)躍遷（原子或分子中的電子，總是處在某一種運(yùn)動(dòng)狀態(tài)之中。每一種狀態(tài)都具有一定的能量，屬于一定的能級(jí)。這些電子由于各種原因（如受光、熱、電的激發(fā)）而從一個(gè)能級(jí)轉(zhuǎn)到另一個(gè)能級(jí)，稱為躍遷。）當(dāng)這些電子吸收了外來(lái)輻射的能量就從一個(gè)能量較低的能級(jí)躍遷到一個(gè)能量較高的能級(jí)。因此，每一躍遷都對(duì)應(yīng)著吸收一定的能量輻射。具有不同分子結(jié)構(gòu)的各種物質(zhì)，有對(duì)電磁輻射顯示選擇吸收的特性。吸光光度法就是基于這種物質(zhì)對(duì)電磁輻射的選擇性吸收的特性而建立起來(lái)的，它屬于分子吸收光譜。躍遷所吸收的能量符合波爾條件：
二,應(yīng)用范圍
紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)可用于物質(zhì)的定量分析、結(jié)構(gòu)分析和定量分析。而且還能測(cè)定某些化合物的物理化學(xué)參數(shù)，如摩爾質(zhì)量、配合物的配合比例和穩(wěn)定常熟、酸堿電離常數(shù)等。
1．定性分析
緊外－可見(jiàn)分光光度法對(duì)無(wú)機(jī)元素的定性分析應(yīng)用較少，無(wú)機(jī)元素的定性分析可用原子發(fā)射光譜法或化學(xué)分析的方法。在有機(jī)化合物的定性鑒定和結(jié)構(gòu)分析中，由于紫外－可見(jiàn)光譜較簡(jiǎn)單，特征性不強(qiáng)，因此該法的應(yīng)用也有一定的局限性。但是它適用于不飽和有機(jī)化合物。尤其是共軛體系的鑒定，以此推斷未知物的骨架結(jié)構(gòu)。此外，可配合紅外光譜、核磁共振波譜法和質(zhì)譜法進(jìn)行定性鑒定和結(jié)構(gòu)分析，因此它仍不失為是一種有用的輔助方法。
一般有兩種定性分析方法，比較吸收光譜曲線和用經(jīng)驗(yàn)規(guī)則計(jì)算zui大吸收波長(zhǎng)λmax，然后與實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較。
2．結(jié)構(gòu)分析
結(jié)構(gòu)分析可用來(lái)確定化合物的構(gòu)型和構(gòu)象。如辨別順?lè)串悩?gòu)體和互變異構(gòu)體。
3．定量分析
紫外－可見(jiàn)分光光度定量分析的依據(jù)是Lambert-Beer定律，即在一定波長(zhǎng)處被測(cè)定物質(zhì)的吸光度與它的溶度呈線性關(guān)系。應(yīng)此，通過(guò)測(cè)定溶液對(duì)一定波長(zhǎng)入射光的吸光度可求出該物質(zhì)在溶液中的濃度和含量。種常用的測(cè)定方法有：?jiǎn)谓M分定量法、多組分定量法、雙波長(zhǎng)法、示差分光光度法和導(dǎo)數(shù)光譜法等。
4．配合物組成及其穩(wěn)定常數(shù)的測(cè)定
測(cè)量配合物組成的常用方法有兩種：摩爾比法（又稱飽和法）和等摩爾連續(xù)變化法（又稱Job法）。
5．酸堿離解常數(shù)的測(cè)定
光度法是測(cè)定分析化學(xué)中應(yīng)用的指示劑或顯色劑離解常數(shù)的常用方法，該法特別適用于溶解度較小的弱酸或弱堿。
三,儀器結(jié)構(gòu)
1.紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)的主要部件
*的紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)生產(chǎn)廠家有上百家，產(chǎn)品型號(hào)成千上萬(wàn)，但就基本結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，都是由五個(gè)部分組成，即光源、單色器（單色儀）、吸收池、檢測(cè)器和信號(hào)指示系統(tǒng)。如下圖所示：
光源
對(duì)光源的基本要求是：應(yīng)在儀器操作所需的光譜區(qū)域內(nèi)能夠發(fā)射連續(xù)輻射；有足夠的輻射強(qiáng)度和良好的穩(wěn)定性，而且輻射能量隨波長(zhǎng)的變化應(yīng)盡可能小。紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)中常用的光源有熱輻射光源和氣體放電光源兩類。熱輻射光源用于可見(jiàn)光區(qū)。如鎢絲燈和鹵鎢燈；氣體放電光掉用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。
鎢燈和碘鎢燈可使用的范圍在340～2500nm，這類光源的輻射能量與施加的外加電壓有關(guān)，在可見(jiàn)光區(qū)，輻射的能量與工作電壓的4 次方成正比。光電流也與燈絲電壓的n次方（n>l）成正比。因此必須嚴(yán)格控制燈絲電壓，儀器必須備有穩(wěn)壓裝置。
在近紫外區(qū)測(cè)定時(shí)常用氫燈和氘燈，它們可在160～375nm 范圍內(nèi)產(chǎn)生連續(xù)光源。氘燈的燈管內(nèi)充有氫的同位素氘，它是紫外光區(qū)應(yīng)用zui廣泛的一種光源，其光譜分布與氫燈類似，但光強(qiáng)度比相同功率的氫燈要大3～5 倍。
單色器
單色器是能從光源輻射的復(fù)合光中分出單色光的光學(xué)裝置，其主要功能應(yīng)該是能夠產(chǎn)生光譜純度高且波長(zhǎng)在紫外可見(jiàn)區(qū)域內(nèi)任意可調(diào)的單色光。單色器一般由入射狹縫、準(zhǔn)直鏡（透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。其核心部分是色教元件，起分光的作用。單色器的性能直接影響人射光的單色性，從而也影響到測(cè)定的靈敏度、選擇性及校準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系等。
能起分光作用的色散元件主要是棱鏡和光柵。棱鏡常用的材料有玻璃和石英兩種。它們的色散原理是依據(jù)不同波長(zhǎng)光通過(guò)棱鏡時(shí)有不同的折射率而將不同波長(zhǎng)的光分開(kāi)。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱鏡只能用于350～3200 nm 的波長(zhǎng)范圍，即只能用于可見(jiàn)光區(qū)域內(nèi)。石英棱鏡適用的波長(zhǎng)范圍較寬，可從185～4000nm，即可用于紫外、可見(jiàn)、近紅外三個(gè)光域。
光柵是利用光的衍射與干涉原理制成的。它可用于紫外、可見(jiàn)及近紅外光域，而且在整個(gè)波長(zhǎng)區(qū)具有良好的、幾乎均勻一致的分辨能力。它具有色散波長(zhǎng)范圍寬、分辨本領(lǐng)高、成本低、便于保存和易于制備等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是各級(jí)光譜會(huì)重疊而產(chǎn)生干擾。
入射、出射狹縫，透鏡及準(zhǔn)直鏡等光學(xué)元件中狹縫在決定單色器性能上起重要作用。狹縫的大小直接影響單色光純度，但過(guò)小的狹縫又會(huì)減弱光強(qiáng)。
吸收池
吸收池用于盛放分析試樣，一般有石英和玻璃材料兩種。石英池適用于可見(jiàn)光區(qū)及紫外光區(qū)，玻璃吸收池只能用于可見(jiàn)光區(qū)。為減少光的反射損失，吸收池的光學(xué)面必須*垂直于光束方向．在高精度的分析測(cè)定中（紫外區(qū)尤其重要）,吸收池要挑選配對(duì)。因?yàn)槲粘夭牧系谋旧砦馓卣饕约拔粘氐墓獬涕L(zhǎng)度的精度等對(duì)分析結(jié)果都有影響。
檢測(cè)器
檢測(cè)器的功能是檢測(cè)光信號(hào)、測(cè)量單色光透過(guò)溶液后光強(qiáng)度變化的一種裝置，常用的檢測(cè)器有光電池、光電管和光電倍增管等。它們通過(guò)光電效應(yīng)將照射到檢測(cè)器上的光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。對(duì)檢測(cè)器的要求是：在測(cè)定的光譜范圍內(nèi)具有高的靈敏度；對(duì)輻射能量的響應(yīng)時(shí)間短，線性關(guān)系好；對(duì)不同彼長(zhǎng)的輻射響應(yīng)均相同，且可靠；噪音低，穩(wěn)定性好等。
硒光電池對(duì)光的敏感范圍為300～800nm ，其中又以500～600nm zui為靈敏。這種光電池的特點(diǎn)是能產(chǎn)生可直接推動(dòng)微安表或檢流計(jì)的光電流，但由于容易出現(xiàn)疲勞效應(yīng)而只能用于低檔的分光光度計(jì)中。
光電管在紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)上應(yīng)用較為廣泛。它的結(jié)構(gòu)是以一彎成半圓柱形的金屬片為陰極，陰極的內(nèi)表面涂有光敏層，在圓柱形的中心置一金屬絲為陽(yáng)極．接受陰極釋放出的電子。兩電極密封于玻璃或石英管內(nèi)并抽成真空。陰極上光敏材料不同，光譜的靈敏區(qū)也不同。可分為藍(lán)敏和紅敏兩種光電管，前者是在鎳陰極表面上沉積銻和艷，可用于波長(zhǎng)范困為210～625 nm；后者是在陰極表面上沉積了銀和氧化艷。可用范圍為625～1000nm。與光電池比較，它有靈敏度高、光敏范圍寬、不易疲勞等優(yōu)點(diǎn)。
光電倍增管是檢測(cè)微弱光zui常用的光電元件，它的靈敏度比一般的光電管要高200 倍，因此可使用較窄的單色器狹縫，從而對(duì)光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)有較好的分辨能力。
信號(hào)指示系統(tǒng)
它的作用是放大信號(hào)并以適當(dāng)方式指示或記錄下來(lái)。早期常用的信號(hào)指示裝置有直讀檢流計(jì)、電位調(diào)節(jié)指零裝置以及數(shù)字顯示或自動(dòng)紀(jì)錄裝置等。現(xiàn)在很多型號(hào)的分光光度計(jì)都可配套計(jì)算機(jī)使用，一方面可對(duì)分光光度計(jì)進(jìn)行操作控制，另一方面可進(jìn)行數(shù)據(jù)處埋。
2．紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)的分類
紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)的類型很多，但可歸納為三種類型：?jiǎn)喂馐止夤舛扔?jì)、雙光束分光光度計(jì)和雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)。
單光束分光光度計(jì)
其光路示意圖如前圖（紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)圖）所示，經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過(guò)參比溶液和樣品溶掖，以進(jìn)行吸光度的測(cè)定。這種類型的分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便，維修容易，適用于常規(guī)分析。國(guó)產(chǎn)722型，751型、724型、英國(guó)SP500型以及Backman DU－8 型等均屬于此類光度計(jì)。
雙光束分光光度計(jì)
其光路示意如下圖所示，經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡（M1）分解為弧度相等的兩束光，一束通過(guò)參比池，另一束通過(guò)樣品池。光度計(jì)能自動(dòng)比較兩束光的強(qiáng)度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對(duì)數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成吸光度并作為波長(zhǎng)的函數(shù)記錄下來(lái)。雙光束分光光度計(jì)一般都能自動(dòng)記錄吸收光譜曲線。由于兩束光同時(shí)分別通過(guò)參比池和樣品他，還能自動(dòng)消除光源強(qiáng)度變化所引起的誤差。這類儀器有國(guó)產(chǎn)710 型、730型和740型，日立220系列，島津－210，英國(guó)UNICAM SP－700等等。
雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)
其基本光路如下圖所示。由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經(jīng)過(guò)兩個(gè)單色器，得到兩束不同波長(zhǎng)的單色光；再利用切光器使兩束光以一定的頻率交替照射同一吸收池，然后經(jīng)過(guò)光電倍增管和電子控制系統(tǒng)，zui后由顯示器顯示出兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸光度差值ΔA （ΔA = A1-A2）。
雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)的優(yōu)點(diǎn)：對(duì)于多組分混合物、混濁試樣（如生物組織液）的分析，以及存在背景于擾或共存組分吸收干擾的情況下，利用雙波長(zhǎng)分光光度法，往往能提高方法的靈敏度和選擇性。利用雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)，能獲得導(dǎo)數(shù)光譜。通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換，使雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)能很方便地轉(zhuǎn)化為單波長(zhǎng)工作方式。如果能在兩波長(zhǎng)處分別記錄吸光度隨時(shí)間變化的曲線，還能進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究。
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